外源蛋白表达过程中谷氨酸棒状杆菌转录组及代谢物的多变元分析

孙杨，刘秀霞，董贵斌，杨艳坤，白仲虎*

1(江南大学，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122) 2(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 3(江南大学，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

摘 要以谷氨酸棒状杆菌为研究对象，在发酵罐水平30%溶解氧条件下对野生菌及表达EGFP的工程菌进行平行培养，对培养20 h的菌体进行转录组分析，并对不同时间点所取样品进行代谢物检测。利用多变元分析方法分析转录组和代谢物数据，其中主要利用主成分分析法进行关键因素分析，利用正交偏最小二乘法判别分析进行转录组数据分析，继而通过S-plot得到不同溶解氧下的生物标记物(biomarkers)，最终找到了8个关键基因。代谢数据分析结果表明ATP、谷氨酸、乙酸、胞内谷氨酸、甲硫氨酸及乳酸是外源蛋白表达的关键代谢物；通过不同时间点代谢物含量变化分析发现外源蛋白表达的代谢变化类似于低氧环境下的代谢变化现象，即糖酵解增强，TCA溢流，回补途径增加，乙酸、乳酸生成增加。通过对比外源蛋白表达工程菌与野生菌的转录组数据及代谢物含量数据，为今后在代谢工程中菌株改造、优化代谢获得高效表达外源蛋白的谷氨酸棒状杆菌表达宿主奠定基础。

关键词：谷氨酸棒状杆菌；多变元分析；正交偏最小二乘法判别分析)；关键基因；转录组测序

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum,C.glutamicum)作为一种革兰氏阳性菌，由于其独特的优点，例如与大肠杆菌表达系统相比具有胞外分泌表达外源蛋白、不产生内毒素等优点[1-2]，近些年被广泛应用于外源蛋白的表达。然而C.glutamicum表达系统存在转化效率低、可用遗传工具少、蛋白表达量低等问题，为解决这些问题，已开展了许多相关研究。如构建和优化适合表达外源蛋白的载体，包括启动子、信号肽、目的基因、表达方式的筛选及优化等[3-5]；研究宿主基因的功能分析和调控机制，找出影响外源蛋白表达的关键基因用于宿主细胞的改造等。

近年来随着组学不断发展，人们对于C.glutamicum的基因背景更加了解，C.glutamicum基因组大小为3.2 Mb，编码24 000个基因[6]，其大部分基因也得到了注释和分析，然而对于C.glutamicum外源蛋白表达中的相关基因，还没有太多的研究，因此我们通过转录组测序(RNA-sequencing, RNA-seq)的手段，分析发酵罐水平表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的C.glutamicum[7]。首先通过GO (Gene Ontology)、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)途径分析对比了野生菌和表达EGFP工程菌在转录组水平的差异，其次在能量水平和物质水平对2种菌株的差异基因和代谢物进行了分析。在分析转录组数据时，通常控制的筛选标准为差异基因大于两倍，p≤0.05，然而此种设置将会遗漏一部分对于外源蛋白表达的关键基因，因此本文通过利用基于SIMCA的多变元分析(Multivariate Data Analysis, MVDA)方法(PCA，principal component analysis；OPLS-DA, rthogonal Partial Least Squares-Discriiminate Analysis)[8]，对转录组数据进行分析，最终获得了外源蛋白表达过程中的较全面的关键基因。对这些关键基因的研究将有助于加深对外源蛋白表达过程的理解，为提高外源蛋白表达的代谢改造提供新途径和新靶点。最后为了进一步研究EGFP的表达对C.glutamicum胞内关键代谢物的影响，本文通过相同的MVDA方法对不同时间点所取样品的代谢物进行分析研究。

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综上，本文通过利用MVDA的方法(PCA, OPLS-DA)，对转录组原始数据整体进行分析，更加全面地从统计学角度分析了转录组数据，为C.glutamicum的代谢改造提供了关键基因靶点。同样地对代谢数据进行分析，找出了外源蛋白表达的关键代谢物质，对外源蛋白表达相对于野生菌的代谢变化的理解提供了更进一步的解释说明和有利证据。

1.1材料

1.1.1 菌株

由实验室保存的张家港华昌制药赠予的谷氨酸棒杆菌命名为CorynebacteriumglutamicumBZH001 (C.glutamicumBZH001)，表达EGFP的工程菌CorynebacteriumglutamicumpXMJ19-EGFP (C.glutamicumEGFP)为本实验室构建并保存的菌种[9]。

1.1.2 试剂和仪器

RNA提取试剂、反转录试剂盒及定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司；ATP检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒检测购于上海碧云天生物有限公司；乳酸、丙酮酸、甲醇以及常用氨基酸均为国产优级纯试剂。

主要仪器有：Applikon EZ-control 5 L发酵罐、安捷伦1200液相色谱仪、超纯水系统、紫外分光光度计、化学发光仪、高通量破碎仪、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪等。

1.1.3 培养基

种子培养基：葡萄糖25 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO41 g/L，尿素2 g/L，玉米浆30 g/L，(NH4)2SO420 g/L，pH 6.8～7.0，1×105Pa，115 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖30 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO41 g/L，玉米浆15 g/L，(NH4)2SO420 g/L，消泡剂万分之0.5，pH 6.8～7.0，1×105Pa，115 ℃灭菌20 min。

1.1.4 软件

商业化的多变元分析软件用于多变元分析(PCA，OPLS-DA) -- SIMCA version 14.0 (MKS UmetricsAB, Sweden)

1.2实验方法

1.2.1 培养方法

从-80 ℃冰箱取保藏甘油管1只，以1%接种量转接于种子培养基中，30 ℃、230 r/min培养12 h后，按10%接种量接于装有200 mL二级种子培养基的1 000 mL带挡板摇瓶中，30 ℃、230 r/min培养12 h。在5 L发酵罐中，控制发酵温度为30 ℃，pH 6.8，通过搅拌转速和氧气偶联控制溶氧在30%，重复发酵3个批次。自动通过添加17%磷酸、纯氨水，维持发酵液pH在6.8左右。在发酵20～22 h时以4 ml/h的速度开始添加300 g/L葡萄糖作为补充碳源，以控制葡萄糖浓度大于5 g/L。20 h时取样，液氮迅速冷冻处理后保存于-80 ℃，待转录组测序时使用。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 转录组分析

总RNA的提取和RNA-seq过程参照[10]，clean reads以FASTQ的格式提交到NCBI的Sequence Read Archive (SRA)，登记号为GSE77502/GSE87077。

1.2.2.2 菌体浓度、葡萄糖、总蛋白量的测定

菌体浓度采用吸光度法测定，葡萄糖含量的测定参照3,5-二硝基水杨酸法(DNS)，总蛋白含量测定采用Bradford方法。

1.2.2.3 氨基酸、有机酸含量测定

氨基酸含量通过OPA衍生化后经高效液相色谱(HPLC)检测[11]。有机酸含量测定参照刘志成等的测定方法[12]。色谱柱采用安捷伦Agilent 1260，Hypersil GOLD (C18) 250 mm×4 mm 5 um，检测器为紫外检测器；检测波长215 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相：0.01 mol/L KH2PO4(pH2.5)：甲醇=97∶3；V=0.6 mL/min。

1.2.2.4 NAD+/NADH、NADP+/NADPH及ATP含量的测定

能量和还原力含量的检测方法参照文献[13]。

1.2.2.5 RT-PCR验证

总RNA的提取通过Trizol法进行提取。通过takara反转录试剂盒反转为cDNA，通过ABI stepone Plus实时定量PCR仪和SYBR RT-PCR试剂盒进行RT-PCR，根据NCBI上基因序列设计相关引物。

表1Real-timePCR所用引物

Table1ThespecialprimerusedbyReal-timePCR

2 结果与分析

2.1转录组数据分析

本文对工程菌C.glutamicumEGFP和野生菌C.glutamicumBZH001进行了3批次平行发酵培养，为了减少其他胁迫带来的影响，控制溶解氧水平为30%，并在16 h开始进行葡萄糖补料，控制葡萄糖浓度不低于5 g/L，并维持其他培养条件保持一致。培养至20 h时野生菌和工程菌都进入稳定期初期，此时细胞比生长速率相同，选取此取样点作为转录组数据取样点，消除了野生菌和工程菌细胞由于处在不同生长时期而造成的差异，另外此时外源蛋白合成速率较大并且有一定的积累(相对荧光表达量36587 RLU/OD600nm)，更容易找出工程菌和野生菌之间的差别。利用Ilumina hiseq 2500进行转录组测序。测序结果表明工程菌和野生菌3个重复批次之间的变异系数CV2.5%，通过原始数据质控之后，clean data 与C.glutamicumATCC13032基因组(NC_003450.3)进行对比，唯一比对到基因组的reads为大于1 600 000，占总reads数84%以上，之后通过NOIseq处理六组clean data，并控制差异表达基因筛选条件为log2 ratio 1以及FDR0.05。以C.glutamicumBZH001作为对照组，C.glutamicumBZH001作为实验组，有244个基因显著下调，319个基因显著上调。差异表达基因中有14个基因log2 ratio 4，其中4个基因为假设蛋白(NCgl1413, NCgl2845, NCgl2837及NCgl0910)，5个基因没有相关注释，其余5个基因(NCgl0055，NCgl0487，NCgl0833，NCgl0909及NCgl0303)的功能涉及转录、翻译、转运等生命活动。其中NCgl0055与转录调控有关；NCgl0487(编码与翻译的延伸功能有关的50S核糖体蛋白L3 (rplC))出现约95倍的下调，而NCgl0833(编码50S核糖体蛋白L33 (rpmG))出现24.18倍下调，有一个锌指结构域。这两个核糖体蛋白基因表达的下调可能跟EGFP表达的特殊性有关，但具体的原因还需进一步研究。NCgl0909(编码ABC转运体ATP酶)出现显著性的上调，这意味着ATP结合性盒式转运蛋白系统对糖类和氨基酸等底物的跨膜转运活动的增加，为EGFP的表达提供足够的底物。NCgl0303编码的CspA家族的冷激蛋白与CspB同属细胞膜蛋白类，有报道CspB蛋白突变体能促进Fab抗体的分泌[14]。

差异表达基因进一步通过KEGG数据库(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)和David数据库(https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp)进行pathway和GO功能分析，发现差异基因富集最多的pathway为不同环境微生物代谢途径，有46个差异基因的富集。而与代谢相关的糖酵解/糖异生、碳代谢、磷酸戊糖途径和丙酮酸代谢也有相关的富集。另外有5个差异基因富集到磷酸转移酶(phosphotransferase system, PTS)系统。PTS系统与糖的胞外向胞内转运有关，通过磷酸化转运葡萄糖到胞内进行物质代谢，从而为外源蛋白的合成提供能量和底物。而GO功能分析结果可以看出，控制p≤0.05，差异基因主要富集在生物过程(4)和分子功能(2)，差异基因富集在生物过程中的有：GO:0009401-磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统、GO:0006355-转录和DNA模板调控、GO:0006096-glycolytic process和GO:0006351-转录和DNA模板。富集在分子功能中的有：GO:0008199-三价铁耦合和GO:0035731-亚硝酸酰基铁复合物耦合。由KEGG和GO分析可以看出差异基因主要集中在中心代谢途径，物质转运过程和翻译过程。由此可见在外源蛋白表达过程中细胞内代谢也发生了显著性变化，通过对这些变化的研究，可以了解外源蛋白表达的特殊性和差异性。

2.2外源蛋白表达过程谷氨酸棒状杆菌转录水平多变元分析

在对转录组数据进行分析时，我们选择了数据过滤阈值，即FDR0.05且foldchange2，这样可以得到可靠的相关差异基因。但是与此同时也会丢失一些数据，即外源蛋白表达过程对C.glutamicum转录水平影响的相关基因。所以我们通过对控制溶解氧水平为30%条件下外源蛋白表达的转录组数据和相同条件下野生菌的转录组数据即标准化的RPKM值进行多变元分析，通过统计学方法(PCA，OPLS-DA)，找出C.glutamicumEGFP与C.glutamicumBZH001转录水平的差异的关键基因。

对于任何数据组进行多变元分析时，先从整体上进行数据分析非常重要，特别是对于分组的数据，整体分析可以看出组内重复性的好坏和组间差异变量，并通过模型的好坏，确定模型的预测性和拟合度，因此我们通过PCA对外源蛋白表达工程菌和野生菌的六组数据及2566个基因进行主成份分析。PCA是通过降维的方法对多变量参数进行降维分析，从而用具有代表性的新变量来解释说明整体变量参数，并对样本进行分类。由模型拟合结果可知，模型被拟合为3个主成分，模型拟合参数：R2X(cum)=0.874，说明模型能够解释说明87.4%的数据变化；Q2(cum)=0.429，说明模型能够预测42.9%的变量，这两个数据说明本次拟合度较好，建立模型的解释能力和预测能力都较好。由loading plot (图1A)可见工程菌和野生菌具有较好的聚类趋势，都位于95%置信区间的Hotelling’s T2椭圆形内，并在t[1]方向上有较好的分离度；野生菌和工程菌在t[2]方向上都有一定的趋势，而这个趋势的存在肯定由某些原因(样本的处理，数据的处理等)造成的，因此通过对这个趋势的分析，会在以后的试验中改进模型的建立。由Score plot (图1B)可知，样本变量在t[1]两侧，分布密度较大，中间较小，因为变量数据较大，无法单独分析边界变量，所以需要进一步对数据进行分析。

A:Loading plot;G: C. glutamicum EGFP样本组;W：C. glutamicum BZH001样本组; B: Score plot

图1 野生菌和工程菌的主成分分析

Fig. 1 PCA analysis result of C. glutamicum EGFP and C. glutamicum BZH001

为了进一步得到工程菌表达过程中相对于野生菌的“biomarker”，我们首先对样本进行分组，分为工程菌(K-30，G-30，I-30)及野生菌(A-30，B-30，C-30)，再进行OPLS-DA分析，并用S-plot进一步分析。通过对数据进行Par scaling，S-plot类似于S型，而S-plot 图中X 轴P[1]代表变量对于分组的影响程度，数值越大代表影响程度越大的变量。P(corr)[1]表示变量对两组样本区分的可信度，范围为-1-1，越接近1表示可信度越大，因此通常在S-plot两端的变量为区分两组样本的“Biomaker”[15]。S-plot作为OPLS-DA中的常用分析方法，被用于代谢物的“biomarker”分析。S曲线的左右两侧红色的数据点即为最有可能造成模型差异的差异基因(图2)。进一步通过VIP图可以得到这些基因对模型贡献的差别。由图2我们选择了57个贡献度最大的基因，这些基因涉及最多的为核糖体蛋白(rpsO、rpsR、rplC、rplJ)、应激蛋白、分子伴侣(冷激蛋白，dnaK)及转录因子等。

图2 OPLS-DA分析(S-plot)

Fig. 2 Analysis result of OPLS-DA S-plot

通过结合在30% DO下的差异基因和多变元分析出的共同基因，我们得到了8个基因(图3A)，其中6个为核糖体蛋白，相关基因为NCgl0487 (50S 核糖体蛋白 L3)、NCgl0833 (50S 核糖体蛋白 L33)、NCgl0519 (50S 核糖体蛋白 L30)、NCgl2279 (50S 核糖体蛋白 L27)、NCgl0489 (50S 核糖体蛋白 L23)和NCgl0496 (30S 核糖体蛋白 S17)，参与到与23SrRNA的结合、肽基转移酶的活性、确保翻译的保真度等生命活动中[16]。另外两个基因，NCgl0303编码冷激蛋白，属于CspA家族，同时也参与转录的调节过程，在工程菌中的表达量大于野生菌；NCgl2632编码的蛋白虽然为假设蛋白，但进行氨基酸序列同源对比发现，该蛋白与乙酰辅酶A乙酰转移酶相似。乙酰辅酶A在代谢中具有重要作用，是从糖酵解进入TCA循环的关键物质，另外在脂肪酸的β氧化中硫解反应也产生乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A乙酰转移酶在分解代谢中起到关键作用[17]，因此NCgl2632可能与蛋白的乙酰化或能量代谢有一定的相关性。选取4个关键基因进行RT-PCR验证，结果表明这些基因与转录组数据相似，并且都具有较大的差异倍数(表2)。为了进一步验证这些基因在外源蛋白表达过程中的作用，需要进一步研究这些基因的相关功能。

2.3代谢物多变元分析

为分析外源蛋白表达引起的代谢物含量变化，我们在发酵过程中每4个小时取一次样，测定细胞内外代谢物含量。从代谢随时间变化的趋势无法对代谢物变化进行整体分析以及代谢物间的相互关系，因此对代谢物也采用多变元分析方法寻找影响本文EGFP表达的关键代谢物。分析对象为C.glutamicumBZH001和C.glutamicumEGFP在发酵罐培养水平8 h、20 h、36 h三个时间点的样品，进行PCA分析(模型拟合为5个主成分，R2(cum)=0.932，Q2(cum)=0.631)。由图4可见，同一样本组沿平行方向被聚类在一起，并且同一取样时间点的三个样品被聚类在一起，表明实验重复性较好。沿区分三个时间点样本方向的乙酸、PC、ATP三因素为区分不同时间点的关键变量。

A: C. glutamicum EGFP和C. glutamicum BZH001关键基因热图分析；B: 多变元分析得到的关键基因和转录组数据维恩图分析

图3 外源蛋白表达关键基因分析

Fig. 3 Key gene analysis of foreign protein expression

表2差异基因的RT-PCR验证

Table2RT-PCRofDEGs

图4 不同时间点样品代谢物的PCA分析

Fig. 4 PCA analysis result of metabolics of samplings

为找出对EGFP的表达贡献度最大的代谢物，本文进一步对样本进行OPLS-DA分析。图5B为VIP图，是对S-plot (图5A)影响变量的排序。由图5B可见，ATP、谷氨酸、乙酸、胞内谷氨酸(Glu-in)、甲硫氨酸及乳酸为区分C.glutamicumEGFP与C.glutamicumBZH001的biomarker。对C.glutamicumEGFP与C.glutamicumBZH001中代谢物含量分析发现工程菌和野生菌中有较大差异倍数，利用T检验分析P-value显示两组间有显著性的差异(表3)，进一步验证了这六个代谢物在工程菌和野生菌中的差异性，已知外源蛋白在合成过程中，氨基酸的转运、肽链的折叠、蛋白的跨膜运输都需要ATP的参与。而C.glutamicum胞内氨基酸生成中Glu含量最多，因而其对OPLS-DA分析的权重就越大。而乙酸和乳酸作为代谢分析的关键物质，外源蛋白表达过程中工程菌中含量大于野生菌，这与在分析外源蛋白表达过程中发现的外源蛋白表达具有类似于低氧环境下的代谢变化现象是一致的，如图6所示，C.glutamicumEGFP相对于C.glutamicumBZH001葡萄糖消耗增加，糖酵解增强，异柠檬酸裂解酶活性增强，乙醛酸循环增强，亮氨酸和缬氨酸含量增加，谷氨酸和甲硫氨酸合成增加，TCA溢流，PEPK活性增加，回补途径增加，乙酸、乳酸生成增加。TCA还原臂通量减少，而乙酸的生成量增加，促进NADH生成的同时也保证了胞内氧化还原水平的平衡。这些代谢物作为影响外源蛋白表达的关键因素，其合成的变化也影响了碳源的利用和能量的分配。以上结论有助于指导通过分子生物学和系统生物学对宿主进行改造，提高能量和底物在蛋白合成途径中的利用。

表3C.glutamicumEGFP与C.glutamicumBZH001关键代谢物含量分析

Table3CriticalmetaboliteconcentrationanalysisofC.glutamicumEGFPandC.glutamicumBZH001

3 结论与讨论

C.glutamicum作为一种新的蛋白表达宿主具有许多优点，目前被不断地应用在单链抗体、工业酶等方面。为了优化外源蛋白的表达， 其表达系统的构建、表达元件的优化和筛选也是目前研究的热点。我们通过二代测序对在发酵罐水平培养的EGFP表达工程菌和野生菌进行转录组测序， 通过P-value和差异倍数进行差异基因的筛选。但这种分析方法可能会丢失一些相关基因，因此我们首次通过多变元分析方法对EGFP在C.glutamicum中的转录水平的表达量(RPKM)进行相关性分析，通过OPLS-DA找出与外源蛋白表达具有相关性的57个基因，并通过跟差异基因的对比，鉴定8个关键基因，为外源蛋白表达的关键途径的探索和改造提供了新的研究靶点。此外我们又通过对不同时间点两种菌株胞内外代谢物进行同样的多变元分析，找出了ATP、谷氨酸、乙酸、Glu-in、甲硫氨酸、乳酸等与外源蛋白表达相关的代谢物，这与之前所发现的外源蛋白表达出现的类似低溶解氧条件下代谢现象相似(糖酵解增强，TCA shunt，回补途径增加，乙酸、乳酸生成增加)，进一步加深了对外源蛋白表达过程的了解。

A:S-plot; B:VIP图

图5 工程菌和野生菌不同时间点代谢物OPLS-DA多变元分析

Fig. 5 OPLS-DA analysis of metabolics of C. glutamicum EGFP and C. glutamicum BZH001

图6 C. glutamicum EGFP 与C. glutamicum BZH001代谢变化

Fig. 6 Metabolism change between C. glutamicum EGFP and C. glutamicum BZH001.

注：六边形代表酶活，方框表示代谢物，箭头表示上调和下调。G-6-P：6-磷酸-果糖；3-PG：3-磷酸甘油醛；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；PYR：丙酮酸；LDH：乳酸脱氢酶；Lac：乳酸；PDH：丙酮酸脱氢酶；AcCoA：乙酰辅酶A；PC：丙酮酸羧化酶；PEPCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；OAA：草酰乙酸；CIT：柠檬酸；ICIT：异柠檬酸；ICL：异柠檬酸裂解酶；α-KG：α-酮戊二酸；GDH：谷氨酸脱氢酶；Glu：谷氨酸；Suc：琥珀酸；MAL：苹果酸；ICL：异柠檬酸裂解酶；MS：苹果酸合酶。

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MVDAanalysisofRNA- seqandmetabolismdataduringtheprocessofrecombinantproteinexpressioninCorynebacteriumglutamicum

SUN Yang, LIU Xiu-xia, DONG Gui-bin, YANG Yan-kun, BAI Zhong-hu*

1(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTThe engineering strain expressing EGFP (C.glutamicumEGFP) and wild type strain (C.glutamicumBZH001) were cultivated in parallel in 5 L fermenters under 30% dissolved oxygen concentration.Samplings at 20 h were analyzed through RNA-sequencing (RNA-seq).Extracellular and intracellular metabolites and key enzymes’ activity of both strains were investigated.Multivariate data analysis (MVDA) was used to deal with the RPKM data of RNA-seq and metabolism data.The principal component analysis (PCA) was used to analyze the principal component.And the S-plot of OPLS-DA was used to find the biomarkers ofC.glutamicumBZH001 andC.glutamicumEGFP.Eight critical genes were found,and ATP,glutamic acid,acetate,intracellular glutamic acid,methionine and lactate were identified as the critical metabolites.The metabolism-like anaerobic conditions were as followed: the glycolysis was enhanced,the TCA cycle was shunted,and the contents of acetate and lactate increased.This research laid a foundation for optimizingC.glutamicumhost structure to get high protein expression level.

Key wordsCorynebacteriumglutamicum; multivariate data analysis (MVDA); orthogonal partial least squares-discriiminate Analysis (OPLS-DA); critical genes; RNA-sequencing (RNA-seq)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014085

第一作者：博士研究生(白仲虎教授为通讯作者，E-mail：baizhonghu@jiangnan.edu.cn)。

基金项目：国家973 计划项目(No. 2013CB733602)；国家自然科学基金项目(No. 31570034)；江苏省自然科学基金项目(No. BK20150148)；中央高校基本科研业务费专项(No. JUSRP51401A)

收稿日期：2017-02-17, 改回日期：2017-03-09